高保真DNA聚合酶

         Pfu DNA Ploymerase是從克隆有Pyrococcus furiosis DNA Ploymerase基因的大腸桿菌中表達并經過柱純化分離出來的重組蛋白，其分子量為90kD。由于Pfu酶具有3’→5’核酸外切酶活性，它能糾正DNA擴增過程中產生的錯配，而傳統的Taq酶卻不能，其它耐熱DNA Polymerase如Vent、Deep Vent、Tli、UITma等雖具有校正功能，但Pfu酶是目前已發現的所有耐熱DNA Polymerase中出錯率最低的。Pfu酶無5’→3’核酸外切酶活性，PCR反應中的延伸速度一般為0.5-1kb/min，比Taq酶要低。Pfu 酶比Taq酶熱穩定性更好，95℃ 1小時仍保持90%以上的活性，對于GC含量很高的模板，變性溫度可以提高到98℃而不影響其活性。Pfu酶的PCR產物為平末端，可加A處理再與T-載體連接或使用平末端克隆載體。

活性定義：

         1單位(U) Pfu DNA Polymerase活力定義為在74℃，30分鐘內，以活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物，將10 nmol脫氧核苷酸摻入到酸不溶物質所需的酶量。

質量控制：

         SDS-PAGE檢測Pfu DNA Polymerase純度大于99%；經檢測無外源核酸酶活性；PCR方法檢測無宿主殘余DNA；能有效地擴增人類基因組中的單拷貝基因；室溫存放一周，無明顯活性改變。

酶貯存緩沖液：

         50mM Tris-HCl (pH 8.2); 0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 50% glycerol；其他成份。

適用范圍：

         用于DNA的高保真擴增，如基因表達克隆、基因定點突變、細胞內基因點突變的分析（SNP）和末端補平等。

注意事項：

1、PCR反應體系加樣時，最后一步加入Pfu DNA Ploymerase，整個過程宜在冰上操作。

2、取Pfu DNA Ploymerase做PCR反應時，請用高壓滅菌處理過的吸頭。

3、10×Pfu Buffer中含20 mM Mg2+，如PCR反應需要較高Mg2+濃度，請另行加入。

4、 用Pfu酶擴增時，引物的純度要求較高，引物長度大于18個堿基，Tm值在55-80℃之間，引物濃度在0.1-0.5uM之間，比Taq酶略高。